Bacillus subtilis S37-2와 Pseudomonas sp. GHR1-1을 이용한 토마토 시들음병 방제 효과

국립농업과학원 농업미생물과에서 개발된 Pseudomonas sp. GHR1-1과 Bacillus subtilis S37-2 균주를 TSB에 28°C로 48시간 동안 배양하여 10⁷ cfu/mL 농도로 조정하여 사용하였다. 토마토 시들음병을 일으키는 F. oxysporum f. sp. lycopersici(KACC 40037)는 한국농업미생물자원센터에서 분양받아 PDA(Potato Dextrose Agar)에 접종하여 25°C에서 10일간 배양하였다. 페트리디쉬에 생육된 FOL을 직경 0.5 mm borer를 이용해 잘라 MEB(Malt Extract Broth)로 옮겨서 광조건에서 16시간, 암조건에서 8시간 주기로 25°C에서 7일간 배양하였다. 배양 후 4겹의 거즈로 균사를 제거하고, 포자는 hemocytometer를 사용하여 멸균수로 10⁶ cfu/mL 농도가 되도록 희석하였다.

공시 균주의 항균활성 시험을 위해 paper disc법(Murray et al., 1999)으로 생장 억제율을 측정하였다. PDA 중앙에 F. oxysporum 균사 절편을 접종하고, 이로부터 2.5 cm 떨어진 곳에 멸균된 paper disc (advantec, 10mm, lot.71010691)를 올려놓고 각각의 미생물을 65 μL씩 접종하였다. 25°C에서 3일간 배양한 후 disc 주위의 균사 생장억제 정도(inhibition zone)를 조사하여 균사 생장 억제율을 계산하였다.

S37-2와 GHR1-1의 토마토 시들음병 포자발아 억제 효과를 조사하기 위해 FOL 분생포자를 1×10⁴ cfu/mL 농도로 희석하여 현탁액으로 만들어 사용하였다.

제조한 포자현탁액을 96 well microplate에 100 μL 분주하고, 각각의 미생물을 1×10⁷cfu/mL 농도로 조정하여 각각 100 μL를 동일한 well에 분주하였다. 28°C에서 24시간동안 배양한 후 현미경(Leica Microsystems, DE/DFC320) 20×로 분생포자의 발아를 관찰하고 기록하였다. 임의로 30개 포자를 관찰하여 발아관의 길이가 분생포자 길이의 절반 이상 나온 것을 발아라 간주하여 다음과 같은 식으로 환산하여 나타내었다.

S37-2와 GHR1-1 균주의 처리 시기에 따른 토마토 시들음병 방제효과를 검정하기 위해 파종 시 5일 간격 3회 처리, 제2엽 전개 시 5일 간격 3회 처리로 구분하여 시험을 수행하였다. 파종시 처리는 상토에 40구 트레이에 담아 토마토 종자(베타티니, 피피에스)를 파종하였다. 각각의 미생물은 1×10⁷ cfu/ mL 농도로 희석하여 5일 간격으로 3회 주당 20 mL씩 관주 처리하였다. 제2엽 전개 시 처리는 토마토 제2엽이 전개될 때 FOL 포자현탁액을 6.9×10⁶ cfu/mL 농도로 희석하여 접종하고, 각각의 미생물을 1×10⁷ cfu/mL 농도로 희석하여 5일 간격으로 3회 주당 20 mL씩 관주 처리하였다. 대조구로는 시판자재를 권장 희석배수로 희석하여 처리하였고, 5주 후에 시들음병의 발병정도를 조사하였다. 발병 지수는 0=건전, 1=도관이 갈변되나 지상부의 생육은 정상인 것, 2=도관이 갈변되고 지상부의 생육이 약간 억제된 것, 3=도관이 갈변되고 지상부는 생육이 억제되며 약간 황화한 것, 4=생육이 심하게 억제되고 황화하여 시들고 낙엽된 것, 5=고사 등 6단계로 하였다(Cai et al., 2003; Park et al., 2012; Park et al., 2013).

토마토 시들음병 방제효과 검정을 위해 4×10 연결 포트를 이용한 유묘검정 외 모든 실험은 3회 이상 반복하여 이루어졌으며, PASW(PASW Statistics 18)를 사용하여 ANOVA 분석하였다. 처리 평균간 비교를 위해 Duncan’s Mutiple Range Test(DMRT)를 실시하였고, p<0.05 수준에서 통계적 유의성을 검정하였다.

Paper disc법을 이용하여 공시 균주가 토마토 시들음병원균의 생육에 미치는 효과를 Fig. 1에 나타내었다. Table 1에서 보는 바와 같이 Bacillus subtilis S37-2와 Pseudomonas sp. GHR1-1 처리구 모두 병원균의 생육을 억제하였고, 두 균주를 혼합하여 처리한 처리구에서 39.5%로 가장 높은 억제효과를 보였다. 배지 자체 처리구에서는 병원균의 생육을 전혀 억제 하지 못하였으며, 대조구인 생물농약 1과 생물농약 2 원액 처리구에서도 우수한 억제 효과를 보였다. 그러 나 생물농약 1은 권장 희석배수인 500배로 희석하여 처리했을 때는 병원균의 생육을 억제하지 못했다. 따라서 분생포자발아 억제 효과 검정시험과 유묘검정시험에서는 생물농약 2를 가지고 시험하였다.

Fig. 1. Antifungal test of EM(effective microorganisms) by paper disc method against F. oxysporum f. sp. lycopersici. B. subtilis S37-2 (a); Pseudomonas sp. GHR1-1(b); S37-2+GHR1-1(c); TSB(d); Biological agent 1 1×(e); Biological agent 1 500×(f); Biological agent 2 1×(g); Biological agent 2 500×(h).

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유용미생물 처리에 따른 시들음병 포자 발아 억제 효과를 조사한 결과를 Table 2에 나타내었다. 미생물 처리에서 멸균수를 처리한 무처리구에 비하여 포자발아 억제효과를 보였으며, 특히 GHR1-1은 42.68%로포자 발아를 억제하였다. TSB 배지를 단독으로 처리 했을 때와 대조자재를 처리했을 때는 무처리구에 비하여 포자 발아율이 더 증가하였다. 이 결과로 보아 대조자재는 균사생장억제에는 효과적이었으나, 포자 발아억제에는 효과적이지 못한 것으로 사료된다.

처리시기에 따른 토마토 시들음병의 방제효과를 조사하기 위해 온실에서 유묘검정 시험을 실시한 결과를 Table 3에 나타내었다. S37-2와 GHR1-1을 파종기와 제2엽기에 각각 처리하였을 때 대조구의 발병지수가 2.3과 3.0인 것에 반해 S37-2를 처리하였을 때는 발병지수가 각각 1.0과 1.3으로 나타났으며, GHR1-1 을 처리했을 때는 발병지수가 0.1과 1.2로 나타났다. 이것으로 보아 파종기에 처리했을 때 발병지수가 낮아지는 것을 볼 수 있었으며, 파종기에 GHR1-1을 처리했을 때 방제효과가 94.6%로 토마토시들음병에 대한 GHR1-1의 방제효과가 매우 우수한 것을 확인할 수 있었다. 반면에 대조구인 생물농약의 방제효과는 매우 낮았다.

토마토시들음병에 대한 생물적 방제로 토마토 식물로부터 분리한 내생균주 Bacillus amyloliquefaciens FBZ24 균주를 종자처리+종자침지+토양관주+엽면살포 했을 때 효과적으로 발병도를 감소시켰다고 보고하였다(Park et al., 2013). 또한 키틴분해미생물 B. subtilis CRB20 균주를 토마토 종자에 처리했을 때 토마토 시들음병 발병을 감소시켰으며, CRB20 균주와 키틴, CFCW(곰팡이세포벽)을 함께 처리했을 때 토마토 초장, 생체중, 과실수가 증가했다고 보고하였다(Elanchezhiyan et al., 2018).

본 연구에서는 Bacillus subtilis S37-2와 Pseudomonas sp. GHR1-1을 이용하여 토마토 시들음병에 대한 항균활성과 유묘검정을 통해 우수한 병 방제효과를 확인하였다. 이러한 결과는 두 균주가 친환경미생물제로서 활용 가능성이 있다고 보여진다.